مطالعه تجربی امکان اتصال آفلاتوکسین ۱M به باکتریهای بیفیدو باکتر بیفیدوم ، …

0 Comments

CM1=e×Csample/(A×V1) فرمول (۲)
CM1 : غلظت آفلاتوکسین Mدر نمونه مجهول بر حسب نانوگرم در میلی لیتر
e : حجم محلول نهایی در ویال
V1 :حجم عصاره عبور داده شده از ستون(ml20)
A : حجم تزریق به دستگاه
۳-۴-۱-۵- تفسیر
این مرحله به کمک کروماتوگرامهای نمونه، استاندارد و دادههای آن ها انجام شد و میزان بازیافت و محاسبات برای تعیین غلظت محلول ثبت گردید.
۳-۴-۱-۶- آزمایش ها انجام شده در این مرحله از پژوهش
اندازهگیری طیف جذبی بهوسیله اسپکتروفوتومتر، اندازهگیری میزان آفلاتوکسین M1، سری آزمایشهای مربوط به کالیبراسیون اولیه و کنترل های دستگاهی.
۳-۴-۱-۷- محاسبات
انجام مرحله دوم پژوهش
مرحله دوم: اندازه گیری آفلاتوکسین در ماست بر اساس استاندارد BS EN ISO 14501/2007
هدف: کالیبراسیون دستگاهی، اندازه گیری آفلاتوکسین M1 در ماست(Tabari et al., 2011).
۳-۴-۲- اندازه گیری آفلاتوکسین M1 در ماست
۳-۴-۲-۱- آماده سازی و تهیه نمونه:
توسط شیر خشک بدون چربی و بدون آفلاتوکسین، شیر بازساخته بدون چربی با ۵/۱۱% ماده خشک تهیه شد و در دمای ۹۰ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ دقیقه استریل، تا دمای ۴۲ درجه خنک و ۲% از استارترهای رایج ماست (Lactobacillus bulgaricus ،Streptococcusthermophile) وبیفیدوباکتر بیفیدوم استارتر بالک تهیه شده به نمونه اضافه شد.نمونه ها به سه قسمت تقسیم شد و یکی به عنوان شاهد(بدون آفلاتوکسین) و به دو نمونه دیگر آفلاتوکسین با دو غلظت مختلف ۵/۰ و ۱ MRL اضافه شد و برای انکوباسیون آماده شد. مدت زمان انکوباسیون ۶ ساعت بود و از لحظه صفر هر ۳ ساعت نمونه برداری شد.
۳-۴-۳-انجام مرحله سوم پژوهش
مرحله سوم: انجام فرایند تخمیر شیر با استفاده از باکتری های لاکتیکی
هدف: تولید دوغ، بررسی تغییرات آفلاتوکسین در اثر فرایند تخمیر، اثر آفلاتوکسین بر رشد و نمو باکتریهای لاکتیکی، بیفیدوباکتر بیفیدوم ، بررسی تغییرات pH، اسیدیته، چربی در اثر فرایند تخمیر.
۳-۴-۳-۱- آماده سازی و فرایند طراحی نمونه ها
برای انجام این مرحله، به شیر بازساخته فاقد آفلاتوکسین نیاز بود. برای این منظور از شیر خشک بدون چربی (ساخت شرکت لبنیات پاک) که فاقد آلودگی به آفلاتوکسین، باقی مانده آنتی بیوتیک و حداقل میکروارگانیسم، استفاده شد. شیر بازساخته پسس از اضافه کردن خامه توسط مربع پیرسون به میزان ۲ درصد در دمایC º۳۷ بهطور کامل (با RCF g× ۱۰۰۰، به مدت ۵ دقیقه) هموژنیزه گشت . سپس شیر فاقد آلودگی به سه قسمت مساوی تقسیم و به دو قسمت از آن، توسط محلول های استاندارد کاری آفلاتوکسین M1 اضافه گردید (محاسبه میزان محلول استاندارد مورد نیاز، با توجه به غلظت آلودگی، حجم نمونه و غلظت نهایی مورد نظر انجام شد) و بر اساس روش Govaris و همکاران (۲۰۰۱)، با تهیه غلظت های ۰۵/۰ و ۱/۰ میکروگرم در لیتر AFM1 در شیر بازساخته این کار صورت گرفت و به یک قسمت باقی مانده آفلاتوکسین اضافه نگردید. کلیه نمونهها (نمونه شاهد به همراه دو غلظت آلوده شده) بهطور همزمان و طی شرایط یکسان مورد آزمون قرار گرفتند هم چنین کلیه نمونه های شیر، قبل و بعد از اضافه کردن آفلاتوکسین M1 به منظور بررسی وجود آفلاتوکسین (طبق روش اشاره شده) آنالیز شدند.
۳-۴-۳-۲- فراوری نمونه ها
هر سه قسمت شیر در دمایC º۹۲ به مدت min3 حرارت داده شد. سپس جهت اضافه کردن استارتر ماست تا Cº۴۲ خنک گردید. به منظور تهیه ماست از استارتر دنیسکو مورد استفاده در صنایع شیر که حاوی نسبت بالا، مناسب و کارا از باکتری های رایج ماست (نسبت مساوی از S.thermophilus و L.bulgaricus وBB12) است، استفاده شد. استارتر لیوفیلیزه در ml 250 شیر بدون چربی در Cº ۴۲ به مدت یک ساعت فعال گردید. سپس به نسبت ml50 استارتر فعال شده به ازای ۱۰ لیتر شیر اضافه و مخلوط گردید.
سپس هر سری از نمونه های شیر در ۲۰ ظرف پلی‌اتیلنی استریل منتقل و به روش حرارتی درب بندی شدند. عملیات تخمیر در Cº ۴۲ تا رسیدن به pH 6/4 انجام گرفت. پس از تخمیر، نمونه های ماست‌ به نمونه های دوغ تبدیل شدند و به مدت سه هفته در Cº ۴ نگهداری گردید.
۳-۴-۴- آنالیزهای مورد استفاده در این فاز پژوهش:
آزمون pH،آزمون اسیدیته، آزمون چربی، اندازه گیری آفلاتوکسین در نمونه های شیر، اندازه گیری آفلاتوکسین در نمونه های ماست، اندازه گیری آفلاتوکسین در نمونه های دوغ، شمارش باکتریایی.
۳-۴-۴-۱- اندازه گیری pH:
pH ماست ها در دمای Cº ۱۵ با دستگاه pH متر (پس از کالیبراسیون با بافرهای ۴ و ۷) اندازه گیری شد.
۳-۴-۴-۲- آزمون اسیدیته:
آزمایش اسیدیته به روش مرجع ، بر اساس استاندارد شماره ۲۰۸۹ ایران انجام شد. بر این اساس ۹سی سی از نمونه با ۱ سی سی آب مقطر و اضافه کردن چند قطره فنل فتالئین، با سود ۱/۰ نرمال تیترکردیم.
۳-۴-۴-۳-شمارش میکروبی:
آنالیز میکروبی پس از تهیه رقت های متوالی از نمونه های شیر ماست و دوغ بهطور کامل هموژن و یکنواخت شده با محلول رینگر تا رسیدن به رقت۱۳-۱۰ مطابق روشKrasaekoopt و همکاران در سال ۲۰۰۴ ( یک گرم از نمونه ماست باml 9 محلول رینگر استریل) رقیق سازی شد و شمارش سلول های میکروبی به روش مخلوط[۳۴] انجام گرفت. محیط کشت مورد استفاده، دما و زمان گرمخانه گذاری پلیت ها برای (لاکتوباسیلوس بولگاریکوس) محیط MRS آگار و دمایC º۳۷ به مدت ۷۲ ساعت بوده درشرایط هوازی گرمخانه گذاری گردید. جهت شمارش استرپتوکوکوسها از محیط کشت M17 آگار و دمایC º ۳۷ به مدت ۷۲ ساعت استفاده شد.
۳-۴-۵-انجام مرحله چهارم پژوهش
مرحله چهارم: بررسی اثر زمان نگهداری بر پارامترهای متغییر این پژوهش
هدف: بررسی تغییرات آفلاتوکسین در اثر زمان نگهداری، اثر زمان نگهداری بر رشد و نمو باکتریهای لاکتیکی، بررسی تغییرات pH، اسیدیته، چربی طی زمان نگهداری.
در این مرحله، اثر زمان نگهداری بر پارامترهای مورد ارزیابی به ویژه میزان تغییرات آفلاتوکسین که هدف اصلی این پژوهش است، مورد بررسی قرار گرفت. در مدت زمان نگهداری تغییرات جمعیت میکروبی و پارامترهایی مانند تغییرات pH اسیدیته و چربی جهت ارزیابی فرضیه وجود ارتباط میان این تغییرات و حضور باکتریها سنجیده شد.
۳-۴-۵-۱- آنالیزهای این مرحله از پژوهش
عبارتند از: اندازهگیری pH، آزمون اسیدیته، آزمون چربی ، اندازه گیری شمارش باکتریهای لاکتیکی و اندازهگیری آفلاتوکسین موجود در دوغ می باشد.
فصل چهارم
بحث ونتیجه گیری
۴-۱- غلظت آفلاتوکسین
۴-۱-۱- مقایسه غلظت های آفلاتوکسین درماست و دوغ۰۵ /۰ و ۱/۰ مایکرولیتر

مطلب دیگر :
دسترسی به منابع مقالات :بررسی تاثیر روشهای فرآوری و فروش بر ریسک فروش محصول پسته در ...

دانلود کامل پایان نامه در سایت pifo.ir موجود است.