مطالعه تجربی امکان اتصال آفلاتوکسین ۱M به باکتریهای بیفیدو باکتر بیفیدوم ، استرپتوکوکوس ترموفیلوس …

0 Comments

شاخص های متغییر
pHو اسیدیته طی فرایند تخمیر ماست، شمارش باکتریهایی لاکتیکی ضمن تخمیر ماست ونگهداری دوغ، میزان تغییرات آفلاتوکسین M1طی تخمیر ماست و نگهداری دوغ .
شاخص های ثابت
pH پایان فرایند تخمیر، درصد تلقیح آغازگرهای لاکتیکی ، دمای گرمخانه گذاری ماست، دما و زمان تیمار حرارتی شیر ماست زنی، میزان تلقیح آفلاتوکسین M1.
از شیرخشک بدون چربی برای تولید ماست با شاخصهای میکروبی و شیمیایی یکسان در طول مدت مطالعه استفاده گردید (کمترین بار میکروبی، فاقد آنتیبیوتیک و فاقد آفلاتوکسینM1). برای تمامی مراحل درنظر گرفته شده، شیر بازساخته با حل کردن۱۱۵ گرم از شیر خشک در ۸۸۵ میلی لیتر آب یون زدایی شده در دمای ۴۰ درجه سیلیسیوس (برای پودر شیر خشک فوری) آماده سازی شد.
۳-۴- شمای کلی مراحل انجام طرح
تمامی مراحل صورت گرفته در این پژوهش را می توان در پنج مرحله زیر عنوان کرد:
اول: کالیبراسیون دستگاهی و اندازهگیری آفلاتوکسین در شیر بر اساس استاندارد۷۱۳۳ استاندارد ملی ایران.
دوم: اندازه گیری آفلاتوکسین در ماست بر اساس استاندارد۷۱۳۳ استاندارد ملی ایران.
سوم: انجام فرایند تخمیر با استفاده از باکتری های لاکتیکی وبیفیدوباکتر بیفیدوم.
چهارم:تبدیل ماست به دوغ و اندازه گیری آفلاتوکسین در دوغ و بررسی اثر زمان نگهداری بر پارامترهای متغییر این پژوهش بر اساس استاندارد۷۱۳۳ استاندارد ملی ایران.
۳-۴-۱- انجام مرحله اول پژوهش
مرحله اول: کالیبراسیون دستگاهی و اندازه گیری آفلاتوکسین در شیر بر اساس استاندارد ۷۱۳۳ ایران.
هدف: تهیه محلول های استاندارد آفلاتوکسین M1 (محلول ذخیره[۳۱] و استاندارد های کاری)، رسم منحنی کالیبراسیون و کالیبراسیون دستگاهی، اندازه گیری آفلاتوکسین M1 در شیر.
مراحل انجام کار در این فاز از پژوهش می توان به طور خلاصه به صورت زیر می باشد:
رسم منحنی استاندارد کاری آفلاتوکسین
برای رسم منحنی کالیبراسیون، محلول ها با غلظت های ۰۵/۰ تاng 20 آفلاتوکسینM1، در حلال فاز متحرک دستگاه HPLC تهیه شد. این محلول ها تا ۳ هفته در دمای ۲۰- درجه سیلیسیوس قابل نگهداری بودند. برای سهولت عمل، از ویال HPLC استفاده گردید. مقادیر لازم و محاسبه شده از محلول های استاندارد، طبق جدول زیر اضافه گشت و با تبخیر کننده نیتروژن[۳۲] حلال اولیه حذف و در نهایت آب مقطر یون زدایی شده و یا فاز متحرک HPLC اضافه شد.
جدول ۳-۳ مقادیر عددی منحنی کالیبراسیون
نمودار۳-۱ منحنی کالیبراسیون
محاسبه یا بر اساس سطح زیر منحنی های استاندارد با نمونه مجهول با احتساب ضریب رقت محاسبه می شود.
اندازه گیری آفلاتوکسین M1 در شیر
اساس آزمایش، بر مبنای استخراج با ستون ایمونوافینیتی و در نهایت تزریق به دستگاه HPLC با شناساگر FLD بود. هم چنین تنظیمات دستگاهی طبق استاندارد انجام گردید.
در نهایت از روی منحنی بدست آمده و معادله کالیبراسیون غلظتی، سطح زیر پیک مربوط به مجهول و اسپایک را به فرمول داده و غلظت محاسبه گشت. با اسپایک گذاشته شده، میزان بازیافت محاسبه گردید و در نتیجه اثر داده شد.
۱-۳-۴-۱-۱ استخراج
برای اندازه گیری آفلاتوکسین M1 در شیر با دستگاه HPLC، ابتدا آماده سازی نمونه[۳۳] جهت ایجاد امکان تزریق به دستگاه طبق استاندارد (۷۱۳۳ استاندارد ملی ایران) انجام شد. ۱۰ گرم از نمونه را وزن و در ۸۰ میلی لیتر آب ۳۰-۴۰ درجه سانتی گراد حل کردیم و سپس به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رساندیم.۶۰ میلی لیتر از نمونه را سانتریفوژ کردیم و چربی آن را جدا کردیم.۱۰ میلی لیتر از محلول PBS را در مخزن متصل به ستون ریختیم و اجازه دادیم با سرعت ۱ تا ۲ قطره در ثانیه بدون فشار خارجی از ستون عبور کند.۲۰ میلی لیتر از شیر بدون چربی را در مزور ریخته سپس از ستون ایمنوافینیتی عبور دادیم.
۳-۴-۱-۲- آماده سازی ستون ایمونوافینیتی
ستونهای ایمونوافینیتی در یخچال، در دمای ۴ درجه سیلیسیوس نگهداری می شوند. ابتدا ستون ها، به دمای اتاق رسانده و به مخزن متصل گردید. یک قیف ۵ میلی لیتری جهت تسهیل انتقال محلولها به ستون ایمونوافینیتی اضافه گشت. برای فعال سازی ستون، طبق دستورالعمل شرکت لیبیوس ، ۵ میلی لیتر بافر فسفات نمکی با سرعت ۲ تا ۳ میلی لیتر در دقیقه، از ستون عبور داده شد.
۳-۴-۱-۳- تخلیص
حجم ۲۵۰۰ میکرو لیتر را از ستون با سرعت ۲-۳ ml/min عبور دادیم و آن را در یک ویال جمع کردیم و سپس با ورتکس مخلوط کردیم.محتویات ویال را در یک حمام آب گرم دمای ۴۰-۵۰ درجه سانتی گراد خشک کردیم.به داخل ویال ۱ میلی لیتر از فاز متحرک اضافه کردیم و آن را به مدت یک دقیقه توسط ورتکس و ۱دقیقه توسط سونیکتور مخلوط کردیم.محتویات ویال را برای بار دوم با ورتکس به مدت ۱ دقیقه مخلوط کردیم.ستون را با ۲۰ میلی لیتر PBS شستشو دادیم. ( استاندارد۷۱۳۳).
توجه: همیشه قبل از استفاده دمای کلیه ظروف، ستون های ایمونوافینیتی و مایعات مورد استفاده، با دمای اتاق یکسان شود تا از تغییر غلظت آن جلوگیری گردد.
۳-۴-۱-۴- اسپایک گذاری
در هر سری آزمایش ها، اسپایک گذاری برای تعیین صحت انجام کار و علاوه بر آن برای تعیین میزان بازیافت ضروری است. میــزان اسپایک باید در محدوده بیان شده برای آفلاتوکسین M1 و در محدوده حدود تغییرات منحنی استاندارد باشد.( استاندارد۷۱۳۳).
با داشتن منحنی و معادله کالیبراسیون غلظتی، سطح زیر پیک مربوط به مجهول و اسپایک را به فرمول داده و غلظت مربوط محاسبه گشت. با اسپایک گذاری، میزان بازیافت به وسیله رگرسیون حاصل محاسبه شده و در نتیجه تاثیر داده شد. توضیح اینکه این روابط توسط سیستم نرم افزاری دستگاه HPLC قابل استحصال است(بر اساس استاندارد ملی ایران ۷۱۳۳).
نتایج را بر اساس فرمول (۱) و (۲) محاسبه میکنیم.
Wsmp = (signalsmp – b)/a  فرمول (۱)
که در آن :
Wsmp : میزان آلودگی نمونه بر حسب نانوگرم که از منحنی کالیبراسیون بدست می آید.
Signalsmp : سیگنال مربوط به آنالیت در نمونه (سطح زیر پیک آنالیت)
b : عرض از مبدا منحنی کالیبراسیون.
a : شیب منحنی کالیبراسیون.
Signalsmp : شیب خط منحنی کالیبراسیون (a) و (b) عرض از مبدا می باشد که از منحنی کالیبراسیون محاسبه می گردد.
محاسبه در نمونه های مایع

مطلب دیگر :
تحقیق - مطالعه تجربی امکان اتصال آفلاتوکسین ۱M به باکتریهای بیفیدو باکتر بیفیدوم ، ...

برای دانلود متن کامل این فایل به سایت torsa.ir مراجعه نمایید.